비타민 C는 인플루엔자 A 바이러스 (H3N2) 감염의 초기 단계에서 인터페론 -α / β 생산을 통한 항 바이러스 면역 반응에 필수 요소

면역 Netw. 2013 년 4 월; 13 (2) : 70-74. 영어.
2013 년 4 월 30 일 온라인에 게시 됨. https://doi.org/10.4110/in.2013.13.2.70
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비타민 C는 인플루엔자 A 바이러스 (H3N2) 감염의 초기 단계에서 인터페론 -α / β 생산을 통한 항 바이러스 면역 반응에 필수 요소입니다
김예진, 김혜민, 배연, 최지원, 임선영, 이은은, 주 명콩, 황영일, 강재승, 이 왕재
서울 대학교 의과 대학 해부학 실 항산화 면역 비타민 C 연구실 110-799

교신 저자. 강재승, 서울 대학교 의과 대학 해부학 교실, 항산화 면역학 및 비타민 C 연구실 전화 : 82-2-740-8132; 팩스 : 82-2-741-8202; 이메일 : genius29@snu.ac.kr 교신 저자. 이왕재, 서울 대학교 의과 대학 해부학 학교 실 항산화 면역 비타민 C 연구실 전화 : 82-2-740-8208; 팩스 : 82-2-745-9528; 이메일 : kinglee@snu.ac.kr

2013 년 3 월 5 일에 접수; 2013 년 3 월 18 일 개정; 2013 년 3 월 22 일에 수락되었습니다.

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요약

L- 아스코르브 산 (비타민 C)은 특히 인플루엔자 바이러스에 잘 알려진 항 바이러스제 중 하나입니다. 생체 내 항 바이러스 효과는 여전히 논란이 있기 때문에, 우리는 비타민 C가 인간과 같은 비타민 C를 합성 할 수없는 Gulo (-/-) 마우스 를 사용하여 생체 내 인플루엔자 바이러스 감염을 조절할 수 있는지 여부를 조사했습니다 . 먼저, 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 (H3N2 / 홍콩)의 비강 내 접종 후 1 주일 이내에 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스가 만료 된 것을 발견 하였다 . 비타민 C 불충분 한 구로 폐의 바이러스 역가(-/-) 마우스는 확실히 증가했지만 항 바이러스 사이토 카인, 인터페론 (IFN) -α / β의 생산은 감소했습니다. 반대로, 폐에 염증성 세포의 침윤 및 전 염증성 사이토 카인, 종양 괴사 인자 (TNF) -α 및 인터루킨 (IL) -α / β의 생성이 폐에서 증가되었다. 종합하면, 비타민 C는 IFN-α / β의 생산 증가를 통해 감염 초기에, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 생체 내 항 바이러스 면역 반응을 나타낸다.



키워드 :
비타민 C ; 항 바이러스 면역 반응 ; 인플루엔자 A 바이러스 ; Gulo (-/-) 마우스
이동 :1 ,2 ) 및 호르몬 생성, 콜라겐 합성과 같은 생리적 반응을위한 효소 적 보조 인자 (3 ) 및 면역 강화 (4 -6 ). 당연히 비타민 C가 부족하면 여러 기관, 특히 심장과 뇌에 심각한 부상을 입습니다. 이들은 둘 다 더 많은 산소 라디칼을 생성하는 호기성 기관이기 때문입니다. 실제로,인간과 일부 영장류를 제외한 대부분의 동물이 내생 적으로 비타민 C를 합성 할 수 있기 때문에 비타민 C에 대한 생체 내 효과에대한 연구는 어렵다7 ). 그러나 Gulo (-/-) 마우스는 최근 인간과 같은 L-gulono-γ-lactone oxidase (Gulo) 유전자 결손에 의해 개발되었으므로식이 비타민 C (8 ). 비타민 C를 2 주 동안 보충하지 않고 Gulo (-/-) 마우스의혈장에서 비타민 C 농도가 10 ~ 15 % 감소한 것으로 이미보고되었습니다(8 ). 또한비타민 C를 3 주 동안 보충하지 않으면 서 Gulo (-/-) 마우스에서 대부분의 장기에서 비타민 C 수치가 현저하게 감소했다고보고했습니다.9 ).

또한, 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 의 비장에서 T 세포의 수가 감소한다는 것을 발견했습니다 (10 ). 비타민 C가 자연 살해 (NK) 세포 및 종양 특이 적 세포 용해성 T 림프구 (CTL)의 활성을 상향 조절하여 항 바이러스 또는 항 종양 효과를 보이는 것으로 생각되지만 생체 내에서 의 관련 증거는 여전히 불분명합니다. 비타민 C의 생체 내 효과를 조사 할 수없는 이유는 모든 동물이위에서 설명한대로L-glunolactone-γ-oxidase ( Gulo )의 작용을 통해 포도당에서 비타민 C를 합성 할 수 있기 때문입니다.7 ). 그러나, 본 발명자들은 비타민 C가 NK 세포 표면의 활성화 / 억제 수용체의 조절을 통해 NK 세포 활성을 상향 조절한다는 것을 확인 하였다 (우리의 미공개 데이터). 비타민 C와 NK 세포는 감기와 독감 예방과 밀접한 관련이있는 것으로 알려져 있습니다.11 -13 ), 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 (H3N2 / Honkong / 1 / 68)에 대하여 Gulo (-/-) 마우스에서 비타민 C의 생체 내 항 바이러스 효과 및 관련 메커니즘을평가 하였다. 먼저, 야생형, 비타민 C 불충분 한 Gulo (-/-) 마우스 및 비타민 C 불충분 한 Gulo (-/-) 마우스에 인플루엔자 바이러스 20 개 혈구 응집 단위 (HAU)를 비강 내 접종 한 후 생존율을 모니터링 하였다. . 흥미롭게도, 우리는 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스가 1 주일 이내에 만료되었지만 야생형 및 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스는 모두 생존 한 것으로 나타났습니다 ( 그림 1B).). 그러나, 바이러스 접종 후 하루에 비타민 C의 보충은 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 의 사망을 막을 수 없었다 ( 도 1B ). 인플루엔자 바이러스의 생체 내 병인 을 예방하기 위해서는 충분한 양의 비타민 C가 필요하다는 것을 시사합니다 . 또한 H3N2 인플루엔자 바이러스가 사람과 돼지의 순환이 좋으며 돼지의 느린 항원 표류를 보여줍니다 (14 ), 우리는 인간과 돼지 인플루엔자 바이러스 사이의 항원 확산이 증가 할 수 있다고 믿는다. 따라서, 도 1에 도시 된 결과는 비타민 C가 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 인간의 중증 또는 치명적인 손상을 효과적으로 예방할 수 있음을 시사한다. 생쥐에 충분한 양의 비타민 C가 존재하여 생존에 대한 기본 메커니즘을 명확히하기 위해, 우리는 각 실험 그룹의 폐에 바이러스 역가를 조사했습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 비타민 C- 불충분 한 구로 (-/-) 마우스로부터의 폐의바이러스 역가는 야생형 및 비타민 C- 불충분 한 구로 (-)의바이러스 역가와 비교했을 때 10 내지 15 배 증가 하였다(- /-) 마우스. 그러나 Gulo가(-/-) 마우스는 바이러스 접종 후 비타민 C가 보충되었고, 바이러스 복제의 명확한 억제를 관찰 할 수 없었다. 이것은 인플루엔자 바이러스 감염의 초기 단계에서 비타민 C 농도의 중요성을 제공합니다. 즉, 바이러스 감염의 초기 단계에서 비타민 C 농도가 충분히 높으면 인플루엔자 바이러스의 복제를 통한 손상을 효과적으로 예방할 수 있습니다. 그러나 충분하지 않으면 인플루엔자 바이러스의 발병을 예방할 수 없습니다.




그림 1 A 형 인플루엔자 바이러스에 의한
비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 의 사망률 증가 인플루엔자 A 바이러스 (H3N2 / 1 / 68 / 홍콩)의 20 가지 혈구 응집 단위 (HAU)를 야생형 (n = 10), 비타민 C- 충분한 구로 (-/-) 마우스 (n = 10) 및 비타민 C 에 비강 내 접종 하였다. - 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 (n = 10)는 재료 및 방법에 기재된 바와 같다. 그리고 나서 바이러스 접종 후 7 일 동안 마우스의 생존을 모니터링 하였다. (A) H3N2 감염이없는 마우스, (B) 20 HAU의 H3N2 감염이있는 마우스.

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그림 2
비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 폐의 인플루엔자 A 바이러스 복제 증가 폐에서 바이러스 복제 억제에 대한 비타민 C의 효과를 분석하기 위해, 희생 마우스에서 폐를 절제하고 (각 그룹당 n = 10), 재료 및 방법에 기술 된 바와 같이 폐 RNA로부터 폐 RNA를 정제 하였다. 비타민 C의 존재 또는 부재 하에서의 바이러스 복제는 인플루엔자 바이러스 M2 유전자 및 β2m에 대한 특정 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 결정 하였다.

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I 형 인터페론 (IFN), IFN-α 및 -β는 바이러스 감염 후 1-2 일 이내에 그 양이 증가함에 따라 바이러스 병인을 예방하는 데 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다 (15 ,16 ). 이어서 인플루엔자 바이러스의 비강 내 접종 후 각 마우스에서 기관지 폐포 (BAL) 유체 및 혈장에서 IFN-α 및 -β의 양을 측정 하였다. 우리가 예상 한 바와 같이, 비타민 C-불충분로부터 BAL 유체와 플라즈마의 IFN-α의 수준 -β Gulo (- / -) 마우스는 조용한 야생형과 비타민 C 자족에 비해 낮았다 Gulo (- / -) 마우스 ( 도 3A 및 B ). 이 결과는 비타민 C가 제 1 형 IFN의 생성을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 항 바이러스 면역 반응의 생성에 필수적인 요소임을 입증한다. 신호 변환기 및 전사 활성화 제 (STAT)의 인산화는 I 형 IFN이 증가 할 때 수용체의 이량 체화 후 중요한 신호 처리 과정입니다 (17 ,18 ). 비록이 보고서가 제시되지는 않았지만, 우리는 비타민 C 부족시 Gulo (-/-) 마우스에서 T 세포에서 STAT3의 인산화에 대한 결함을 발견했습니다(10 ). 따라서,바이러스 감염시비타민 C- 충분한 구로 (-/-) 마우스에서 STAT의 활성화를추가로 조사해야합니다.




도 3
IFN-α / β 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 의 생산 결함 . 야생형 (n = 6), 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 (n = 6) 및 비타민 C 불충분 한 구로의 BAL 유체에서 IFN-α (A) 및 IFN-β (B) 수준 (-/-) 마우스 (n = 6)를 1 일의 인플루엔자 바이러스 감염 후 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정 하였다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험을 나타내며 각각 3 회 수행됩니다. 값은 평균 ± SD입니다.

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제 1 형 IFN 생산에 따른 결함과 STAT의 활성화는 감염 초기 단계에서 바이러스 복제를 통제하지 못하기 때문에 염증 반응과 밀접한 관련이있다.19 ). 인플루엔자 바이러스 감염에 의한비타민 C- 충분한 구로 (-/-) 마우스의 염증 반응을 조사하기 위해, 야생형, 비타민의 BAL 유체에서 전 염증성 사이토 카인, IL-1α / β 및 TNF-α의 수준을 비교했습니다. C-충분한 Gulo (- / -) 마우스와 비타민 C-불충분 Gulo (- / -) 바이러스 감염 후 생쥐. 결과적으로, IL-IL-1α / β 및 TNF-α의 생성은 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스에서 확실히 증가되었다 ( 도 4A ~ C ). 동시에, 폐로의 염증 세포 침윤은다른 것보다비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스에서 약 2.5 배 증가합니다 ( 그림 4D).). 급성 간 염증의 발병에 대한 비타민 C의 예방 역할에 관한 이전 보고서에서, 우리는 간으로의 면역 세포 침윤의 증가와 비타민 C 불충분 한 구로 에서 TNF-α 생산의 약간의 증가를 관찰했습니다 (- /-) 마우스 (10 ). 그런 다음 과도한 염증 반응은concanamycin A의 생체 내 도전에의해 발생했습니다.10 ). 종합하면 , 생체 내 비타민 C의 불충분 한 상태는 바이러스 / 박테리아 감염 또는 화학 물질에 대한 과민성 면역 반응을 유도하는 것으로 보인다.




도 4 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의한
비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 의 폐에서 IL-α / β 및 TNF-α의 생산 증가 . 야생형 (n = 6), 비타민 C- 충분한 구로 (-/-) 마우스 로부터 얻은 BAL 유체에서 IL-1α (A), IL-1β (B) 및 TNF-α (C)의 수준 (n = 6) 및 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 비타민 C 불충분 한 구로 (-/-) 마우스 (n = 6)를 측정 하였다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험을 나타내며 각각 3 회 수행됩니다. 값은 평균 ± SD입니다. (D) BAL 유체의 원심 분리 후, 비타민 C의 존재 또는 부재 하의 인플루엔자 A 바이러스 감염시 폐로의 침윤 된 면역 세포의 수를 현미경으로 계수 하였다.

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생쥐에서 비타민 C의 혈장 농도는 대략 80 ~ 100µM 인 것으로 일반적으로 알려져 있습니다. 혈장에 비타민 C의 양이 20µM 미만인 경우,이를 비타민 C 부족 또는“부고 분류”라고합니다 (9 ). 비타민 C 철수 후 3 주에 Gulo (-/-) 마우스에서비타민 C의 전신 농도가 10 ~ 20µM 인 것을 고려하면, 우리는 비타민 C 결핍이 아닌 비타민 C 부족의 영향을 나타 냈습니다. 결론적으로, 비타민 C는IFN-IL-1α / β 생산의 증가를 통해 인플루엔자 바이러스에 대한 생체 내 항 바이러스 면역 반응 에서 결정적인 역할을한다. 따라서,식이 또는 보충제를 통한 연속 섭취에 의해 혈장 내에서 충분한 수준의 비타민 C를 유지하는 것이바이러스 감염의 초기 단계에서 인플루엔자 바이러스의 생체 내 발병을효과적으로 예방할 수있다.

이동 :20 ).

IAV의 비강 내 접종

마우스를 마취시키고 20 HAU IAV (홍콩 / 1 / 68, H3N2)를 함유하는 30㎕ PBS를 비강 내 투여 하였다. 이어서, 마우스의 질병 및 사망률을 7 일 동안 매일 모니터링 하였다.

혈액 및 기관지 폐포 (BAL) 체액 수집

IAV 1 일 후, 혈액을 헤파린 처리 된 모세관을 사용하여 안와 신경총에서 채혈했습니다. IFN-α / β (PBL 인터페론 소스, 미국 뉴저지 주 피스 카타 웨이, 미국 뉴저지 주 피스 카타 웨이), IL-1α / β 및 TNF-α (미국 미네소타 주 미니애폴리스 소재의 R & D 시스템)의 레벨을 제조사의 지시에 따라 ELISA를 사용하여 측정 하였다. 1 % 소 혈청 알부민 및 0.1 % NaN 3 (차단 용액)을 함유하는 총 2 ml PBS로 기관 및 폐를 용리시킴으로써 BAL 유체를 수집 하였다. BAL 당 총 세포 수는 현미경으로 계수하여 결정 하였다.

실시간 RT-PCR에 의한 바이러스 복제 분석

순진한 또는 IAV- 감염된 마우스의 총 RNA를 Trizol Reagent (미국 캘리포니아 주 칼스 배드 소재의 Invitrogen)를 사용하여 단리하고 올리고 (dT) 프라이머 및 AMV 역전사 효소 (iNtRON, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 실시간 RT-PCR을 SYBR Green PCR 마스터 믹스 (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)로 처리하고 ExiCycler ™ (Beoneer, 대전)를 사용하여 수행 하였다. IAV M2 유전자 (5'-AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3 '및 5'-CAAAGCGTCTACGC TGCAG TCC-3') 및 마우스 β2m 유전자 (5'-TGTCTCACTGACCGGCCTGT-3 '및 5'-GTTCAGTATGTTCGGCTTCC-3')에 대한 특이 적 프라이머. IAV M2와 β2m의 발현의 차이는 2- Δ (ΔCT) 방법을 사용하여 계산되었다 .

통계 분석

데이터는 평균 ± SD로 제시되었다. 짝을 이루지 않은 양측 t 검정을 사용하여 두 그룹을 비교했습니다 (WT 대 Gulo (-/-) 또는 Gulo (-/-) 대 Gulo (-/-) + 비타민 C). <0.05의 p- 값은 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었다. GraphPad InStat 버전 5.01 (GraphPad Software, Le Jolla, CA)을 사용하여 통계 테스트를 수행 하였다.

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